Produccn
Académica
Galván, Cristian Ariel
Relevancia de los rafts en la
polaridad neuronal e
implicancias de sus
alteraciones en la enfermedad
de Niemann-Pick tipo A
Tesis para la obtencn del tulo de posgrado de
Doctor en Bioquímica
Director: Ledesma Muñoz, María Dolores
Documento disponible para su consulta y descarga en Biblioteca Digital - Producción Académica, repositorio
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CC
|®@©I
UNIVERSIDAD CATOLICA DE CORDOBA
Universidad jesuíta
Facultad de Ciencias Químicas
Relevancia de los rafts en la polaridad neuronal
e implicancias de sus alteraciones en la
enfermedad de Niemann-Pick tipo A"
Tesis para optar al título de Doctor en Bioquímica de la
Universidad Católica de Córdoba
Bioq. Cristian Ariel Galván
Córdoba, 2014
Director de Tesis
PhD. Maa Dolores Ledesma Muñoz
Científico Titular / Jefe de grupo
Consejo Superior de Investigaciones Cienficas (CSIC), España
Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CBMSO), España
Co-Director de Tesis
PhD. Dante Miguel Beltramo
Profesor Titular de la Cátedra de Biotecnología
Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Católica de Córdoba
Investigador Principal del CONICET, Argentina
Investigador Principal del CEPROCOR, Argentina
Comisión de Tesis
PhD. Gabriela Paglini
PhD. Gustavo Baiardi
PhD. Roxana Cano
Lugares de Trabajo
Cavalieri Ottolenghi Scientific Institute, Universita degli Studi di Torino, A.O. San
Luigi Gonzaga, Regione Gonzole 10, 10043 Orbassano (Torino), Italia.
Cátedra de Biotecnología, Facultad de Ciencias Químicas,
Universidad Católica de Córdoba.
Parte de este trabajo de
tesis ha sido financiado por una
beca de posgrado otorgada por
la Universidad Católica de Córdoba.
Est a T e ó íó s t á dedicada
amís gueddos P a d e s
y a m í am ada Fa míüía .
Cada logro es un volver a empezar.
Bendito cada comienzo que nos abre oportunidades
para comunicarnos y poder interactuar.
Muchas gracias a ese mundo de personas,
que en el curso de mi vida y en cada etapa concluida,
me empujaron a volver a empezar.
Los quiero mucho
C r is t ia n a r i e l g a l v á n
RESUMEN
Relevancia de los rafts en la polaridad neuronal e implicancias de
sus alteraciones en la enfermedad de Niemann-Pick tipo A
Una de las principales características de las neuronas es su extremada
polaridad. La diferenciacn tanto morfogica como molecular de
axones y dendritas es necesaria para la funcn neuronal. Defectos en
esta diferenciación pueden contribuir a la patología de distintas
enfermedades neurológicas. Sin embargo, los mecanismos que
establecen y mantienen la polaridad neuronal y sus implicancias
patológicas no esn completamente resueltos. En esta tesis doctoral,
nos hemos centrado en investigar la contribucn a la polaridad
neuronal de los dominios de membrana enriquecidos en colesterol y
esfingolípidos, los llamados rafts. Describimos que los rafts son esenciales
para la distribución axonal de moléculas como la proteína del Prion
(PrPC) o el ganglsido GM1 en neuronas hipocampales maduras y
analizamos la contribucn a este proceso de sus componentes lipídicos
mayoritarios: el colesterol y los esfingolípidos. Los estudios realizados
apuntan al control de la endocitosis dendrítica como factor clave para
la polarización axonal de moléculas de rafts. Además, caracterizamos
las alteraciones de los rafts en el cerebro y neuronas de un modelo
murino para la enfermedad de Niemann-Pick tipo A (NPA). La actividad
deficiente de la esfingomielinidasa ácida (ASM), que causa la
enfermedad, lleva a la acumulación de la esfingomielina (SM) en la
membrana plasmática neuronal. Demostramos que al alterar los rafts
esta acumulación reduce la endocitosis dendrítica de moculas como
PrPC y GM1 impidiendo la unión a membrana de la GTPasa RhoA. Esto
tiene como consecuencia la distribución no polarizada de estas
moculas que aparecen de forma anómala en las dendritas de
neuronas de ratones ASMko. La modulación experimental de los niveles
de SM promueve o previene este fenotipo. En conjunto, los resultados
obtenidos aportan información sobre los mecanismos de polaridad
neuronal y sugieren que defectos en la polaridad pueden jugar un
relevante papel patológico en NPA.
Palabras clave: rafts, polaridad neuronal, esfingomielina, endocitosis,
Niemann-Pick Tipo A.
SUMMARY
Relevance of rafts in neuronal polarity and implications of raft
alterations in Niemann-Pick disease type A
One of the main characteristics of neurons is their extreme polarity.
Morphological and molecular differentiation of axons and dendrites are
necessary for neuronal function. Defects in this differentiation may
contribute to the pathology of neurological diseases. However, the
mechanisms by which polarity is established and mainteined and the
pathological implications of polarity defects are not completely
understood. In this PhD work we have analyzed the contribution to
neuronal polarity of membrane domains enriched in cholesterol and
sphingolipids, the so called rafts. We describe that rafts are required for
the axonal distribution of molecules such as the Prion protein (PrPC) and
the ganglioside GM1 in mature hipocampal neurons. We have analyzed
the contribution to the process of the two main lipid components of rafts:
cholesterol and sphingolipids. Our studies indicate that the control of
dendritic endocytosis is a key event for raft molecule polarization.
Moreover, we have characterized raft alterations in the brain and
neurons of a mouse model for Niemann-Pick disease type A (NPA).
Deficient activity of the acid sphingomyelinase (ASM), which causes the
disease, leads to sphingomyelin (SM) accumulation at the plasma
membrane of neurons. We demonstrate that, through raft alteration, this
accumulation impairs dendritic endocytosis of PrPC and GM1 preventing
the binding to the membrane of the small GTPase RhoA. This, in turn,
leads to the unpolarized distribution of these molecules that remain in
dendrites of ASMko neurons. Experimental modulation of SM levels
promotes or prevents these defects. Altogether the results obtained bring
information on neuronal polarity mechansims and suggest that defects
on them play a relevant pathological role in NPA.
Key words: rafts, neuronal polarity, sphingomyelin, endocytosis,
Niemann-Pick type A.
ÍNDICE
J
AGRADECIMIENTOS
RESUMEN
SUMMARY
. INTRODUCCION
1.1 La membrana celular: Breve introducción a un sistema dinámico y complejo 1
1.2 Composición de la membrana plasmática celular 3
1.2.1 Bicapa lipídica 4
1.2.2 Componentes lipídicos 5
1.2.3 Componentes proteicos 8
1.2.4 Componentes glucídicos 10
1.3 Microdominios de membrana: Balsas lipídicas (Rafts) como estructuras de 11
membrana altamente organizdas
1.4 Importancia de los rafts en el desarrollo neuronal 15
1.5 Niemann-Pick Tipo A: "Un ejemplo de enfermedad neurológica causada por 19
alteraciones en el metabolismo de lípidos
. HIPOTESIS Y OBJETIVOS
. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Modelo experimental murino
3.2 Reactivos y anticuerpos
3.3 Cultivos celulares: Cultivo primario de neuronas hipocampales provenientes
de rata y ratón
25
26
28
3.4 Estudios realizados con neuronas hipocampales de rata
3.4.1 Purificación de rafts usando Triton X-100
3.4.2 Purificación de rafts por sonicación
31
31
32
23
25
3.4.3 Reducción de colesterol 32
3.4.4 Reducción de Esfingolípidos 32
3.4.5 Análisis de la viabilidad celular 33
3.4.6 Análisis lipídico 33
3.4.7 Ensayos de Inmunofluorescencia 34
3.4.8 Electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) y Western blot 36
3.4.9 Ensayos de endocitosis 37
3.4.10 Ensayos de microscopía electrónica con el uso de anticuerpos 38
3.5 Estudios realizados con neuronas hipocampales de ratón 39
3.5.1 Aislamiento de membranas libres de lisosomas y de fracciones 39
enriquecidas en membranas del aparato de Golgi
3.5.2 Electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) y Western blot 40
3.5.3 Electroforesis bidimensional en geles de poliacrilamida (2D-PAGE) 41
3.5.4 Análisis de Fosfoproteínas presentes en rafts 43
3.5.5 Aislamiento de rafts de membranas totales o membranas de Golgi 44
3.5.6 Extracción depidos y análisis por cromatografía de capa delgada (TLC) 44
y Slot blot
3.5.7 Cuantificación de lípidos por ensayos enzimáticos y HPLC 45
3.5.8 Tratamiento de neuronas hipocampales con SM o Smasa 46
3.5.9 Ensayos de inmunofluorescencia 46
3.5.10 Ensayos de inmunomarcación in-situ 48
3.5.11 Transfecciones, estudio de expresión y tráfico de GFP-GPI 48
3.5.12 Ensayos de endocitosis 49
3.5.13 Ensayos de actividad de RhoA y Cdc42 50
3.5.14 Transfección de RhoA constitutivamente activo 50
3.6 Análsis Estadístico 51
4. DESARROLLO y RESULTADOS
52
4.1 CAPÍTULO I: Proteína prionica (PrPC) como candidato proteico para analizar
polarización neuronal dependiente de rafts
53
4.1.1 Análisis de la distribución polarizada de PrPC en neuronas hipocampales
de rata
53
4.1.2 Asociación de PrPC a rafts en neuronas hipocampales 61
4.1.3 Importancia de los rafts en la distribución axonal de PrPC en neuronas
hipocampales maduras: efecto de la modulación del colesterol
68
4.1.4 Importancia de los rafts en la distribución axonal de PrPC en neuronas
hipocampales maduras: efecto de la modulación de los esfingolípidos
72
4.1.5 Papel crítico de los rafts en la endocitosis de PrPC en neuronas
hipocampales maduras
77
4.2 CAPÍTULO II: Aletaraciones de la polaridad neuronal en la enfermedad de
Niemann-Pick Tipo A: Relevancia de los rafts
83
4.2.1 Alteraciones en la composición lipídica de los rafts neuronales en
ausencia de ASM
83
4.2.1.1 Análisis lipídico de rafts provenientes de membranas totales de
cerebros y de cultivos primarios neuronales de ratones wt y ASMko
83
4.2.1.2 Análisis lipídico de rafts provenientes de membranas de Golgi 90
4.2.1.3 Análisis lipídico de rafts provenientes de membrana plasmática
neuronal
92
4.2.2 Composición proteica de rafts neuronales en ausencia de ASM 95
4.2.2.1 Análisis proteico de rafts provenientes de membranas totales de
cerebro
95
4.2.2.2 Análisis proteico de rafts provenientes de cultivos primarios
neuronales
99
4.3 CAPÍTULO III: Alteraciones de las funciones de rafts, particularmente en la 101
distribución polarizada de proteínas neuronales en ausencia de ASM
4.3.1 Análsis de la distribución polarizada de moléculas de rafts en neuronas
hipocampales de ratones ASMko
101
4.3.2 Análsis del tráfico exocítico del dominio GPI en neuronas hipocampales 108
de ratones ASMko
4.3.3 Análsis de la endocitosis de moléculas de rafts en neuronas
hipocampales de ratones ASMko
111
4.3.4 El aumento de SM es responsable de la endocitosis deficiente de
moléculas de rafts en neuronas hipocampales de ratones ASMko
114
4.3.5 Alteraciones en la unión a membrana de RhoA reducen la endocitosis
de moléculas de rafts en neuronas ASMko
119
. DISCUSIÓN
5.1 Relevancia de los rafts en la polarización axonal: mecanismo molecular
5.2 Polarización axonal de PrPC en neuronas hipocampales: implicancias
fisiológicas y patológicas
123
127
5.3 La ASM como moduladora de la composición proteica y lipídica de la MP:
implicancias para NPA
128
5.4 Modulación de la SM como posible terapia para NPA: efecto en otros
lípidos?
130
6. CONCLUSIÓN FINAL
7. ABREVIATURAS
8. REFERANCIAS
9. PUBLICACIONES
123
134
151
1. INTRODUCCN
1.1 LA MEMBRANA CELULAR: BREVE INTRODUCCIÓN A UN SISTEMA DINÁMICO Y
COMPLEJO.
La membrana plasmática (MP) es una estructura laminada dispuesta como
una bicapa lipídica que delimita todas las células. Es compuesta por lípidos,
proteínas y gcidos. Esta membrana determina la morfología y contribuye a
mantener el equilibrio entre el interior y el exterior celular (Fig. 1). Gracias a su
permeabilidad selectiva, tiene la capacidad de regular el paso de agua,
iones y metabolitos conservando estable el medio intracelular a la vez que
mantiene el potencial electroquímico. Además, la MP recibe las señales del
exterior celular transfiriéndolas al interior y desencadenando la respuesta a
estímulos (Alberts y col., 2006).
INTRODUCCIÓN | 2
Núcleo
Citoplasma
Figura 1. Ilustración de la membrana plasmática de una célula eucariota. Figura adaptada de
Alberts y col. (2006)
Durante mucho tiempo se creyó que la MP era una simple barrera estática
formada por la sucesión de capas proteínas-lípidos-lípidos-proteínas. Hoy en
día se concibe como una estructura dinámica cuyo modelo se conoce como
INTRODUCCIÓN | 3
mosaico fluido”, término acuñado por S.J. Singer y G.L. Nicholson en 1972.
Explicar los cambios en la fluidez de las membranas, sus causas y sus
consecuencias ha centrado la atención no sólo de biólogos sino también de
físicos debido a sus fascinantes propiedades. En los últimos años se han
develado un gran número de estructuras moleculares de proteínas de
membrana y principios básicos a los que responde la organizacn de la MP.
En el escenario actual la MP se concibe como una estructura
compartimentalizada en dominios muy dinámicos de escala nanométrica. En
ella, los pidos han dejado de considerarse meros elementos estructurales
para pasar a tener un papel activo en dicha compartimentalizacn, que es
esencial para el tráfico y la señalizacn intracelular (Gorter & Grendel, 1925;
Engelman, 2005; Jacobson y col., 2007; Coskun & Simons, 2010; Simons &
Sampaio, 2013).
1.2 COMPOSICIÓN DE LA MEMBRANA PLASMÁTICA CELULAR.
La composición química de la MP varía entre células dependiendo de la
función que ejercen o del tejido en el que se encuentren. De manera general
esta membrana es compuesta por una doble capa de fosfolípidos a la que
se unen proteínas y gcidos. Las moléculas s numerosas son las de lípidos
estimándose que por cada 50 pidos hay una proteína. Sin embargo, las
proteínas, debido a su mayor tamaño, representan aproximadamente el 50%
INTRODUCCIÓN | 4
de la masa de la membrana (Alberts y col., 2006) (Fig. 2).
Figura 2. Esquema general de una membrana celular. Según el modelo de mosaico fluido, las
proteínas (en violeta) serían como icebergs que navegarían en un mar de lípidos (en celeste).
Figura adaptada de Alberts y col. (2006)
1.2.1 BICAPA LIPÍDICA.
El orden de las cabezas hidrofílicas y las colas hidrofóbicas de la bicapa
lipídica impide que solutos polares, como sales minerales, agua, carbohidratos
y proteínas, difundan a través de la membrana permitiendo en general la
difusión pasiva de moléculas hidrofóbicas.
La doble capa lipídica de la MP se forma espontánemante gracias a la
propiedad que poseen las mitades hidrofóbicas de los lípidos de asociarse
entre ellas y a la tendencia de las porciones hidrofílicas a interactuar con
ambientes acuosos (Fig. 3). Esta característica anfipática de los lípidos es la
propiedad química que permite a laslulas aislar su interior y este mismo
principio permite a nivel subcelular el ensamblaje de las membranas de las
organelas.
INTRODUCCIÓN | 5
Figura 3. Diagrama del orden de los lípidos antipáticos para formar una bicapa lipídica. Las
cabezas polares (de color anaranjado) separan las colas hidrofóbicas (de color azul) del
medio citosólico y extracelular.
1.2.2 COMPONENTES LIPÍDICOS.
El 98% de los lípidos presentes en las membranas celulares son anfipáticos. Los
más abundantes son los fosfolípidos y los esfingolípidos (SLs), que se
encuentran en todas las células; le siguen los glicolípidos y los esteroles
(principalmente colesterol).
Los fosfolípidos tienen una mocula de glicerol con la que se esterifica un
ácido fosfórico y dos ácidos grasos de cadena larga; los principales
fosfolípidos de membrana son la fosfatidiletanolamina (PE), la fosfatidilcolina
(PC), el fosfatidilinositol (PI) y la fosfatidilserina (PS) (Alberts y col., 2002).
Los SLs, son pidos de membrana constituidos por ceramida (esfingosina +
ácido graso); donde solo la familia de la esfingomielina (SM) posee sforo; el
INTRODUCCIÓN | 6
resto posee glúcidos, por lo que se denominan glucoesfingolípidos. Los
cerebrósidos poseen principalmente glucosa, galactosa y sus derivados (N-
acetilglucosamina y N-acetilgalactosamina). Los gangliósidos contienen una
o s unidades de ácido siálico (Futerman & Hannun, 2004) (Fig. 4).
El colesterol representa un porcentaje importante (en torno al 20% en
células de mamífero) de los lípidos de membrana. Sus moléculas son más
pequeñas y anfipáticas en comparación con otros lípidos entre los que se
intercala. Se dispone con el grupo hidroxilo hacia el exterior de la célula por su
afinidad con el agua. Dadas sus características y abundancia, el colesterol es
un factor clave para controlar la fluidez y permeabilidad de la membrana. A
mayor cantidad de colesterol menos permeable y fluida es la misma.
INTRODUCCIÓN | 7
Fosfolípidos
D
II
Ft]— C 0 CH;
0 I
II I
Fo sfa tid ile ta no la m in a
R-,— C — O (
O
II
Fosfatid ilco lin a
I H2 h2
H?c o po - c -c -NH-4
R2C - C - C H
M2 1-2
H2 O — R - O - C -C -N(CH3)a"
Cr
0
II
Fo sfatid ilserin a
II 1
r , a i —cu
I 0
I II H2 H
h 2c o p - o c - c — n h 3
O' ^
u CÜ O-
Esfingolípidos
11 9
CH _ c = o - c h— h - -
-{CHihi C C C-CH CHS O J C
H O H N H O
I
+
j —M(C Hj )j
Esfin go m ielin a
Esteroles
Figura 4. Estructuras químicas de los principales lípidos constitutivos de la membrana
plasmática. Figura adaptada de Blanco A. (2007)
INTRODUCCIÓN |8
De manera general se postula que lospidos de membrana se podrían
encontrar en dos formas: como un líquido bidimensional o como una
estructura más ordenada formando las llamadas balsas lipídicas (rafts) en las
que el colesterol y los SLs juegan un papel esencial y de las que daremos
detalle s adelante (Mouritsen & Zuckermann, 2004).
Por su protagonismo en esta tesis doctoral merece especial atención la
composicn lipídica de las membranas neuronales. Si bien esta composición
puede variar dependiendo del tipo neuronal, las células nerviosas presentan
membranas particularmente enriquecidas en SLs, gangliósidos y colesterol,
(Sonnino & Prinetti, 2013).
1.2.3 COMPONENTES PROTEICOS.
Las proteínas de la MP son responsables de funciones tales como transporte,
adhesion, recepción y transduccn de señales, proteolisis o calisis
(enzimas). Se pueden clasificar según el modo de disposición en la bicapa
lipídica como:
-1- Proteínas integrales: Embebidas en la bicapa lipídica atravesando la
membrana una o varias veces (proteínas transmembrana) o mediante
enlaces covalentes con un lípido o un gcido. Estas proteínas
representan aproximadamente el 80% de las proteínas de membrana.
-I- Proteínas periféricas: A un lado u otro de la bicapa lipídica se unen
débilmente a la membrana por enlaces no covalentes. Entre ellas, se
encuentran proteínas que incorporan a su molécula una modficación
INTRODUCCIÓN | 9
lipídica como el grupo glicosil fosfatidil inositol (GPI) o el ácido palmítico.
Estas proteínas representan el 20% de las proteínas de membrana.
La distribución de las proteínas en la MP es clave para su funcn y en
muchos casos, esta distribución no es homogénea sino polarizada. Las
neuronas, tipo celular que centra el presente trabajo de tesis, son el
paradigma de la polaridad celular y la especialización a nivel de membrana.
Este tipo celular posee dos tipos de procesos, molecular y funcionalmente
distintos, los axones y las dendritas, que tienen además dominios
especializados como la sinapsis. En las neuronas, el alto grado de polarización
produce la especificación local de sus funciones, en sitios eventualmente
muy lejanos, como ocurre por ejemplo en las neuronas del tracto cortico-
espinal (Horton & Ehlers, 2003). A establecer la organización de las
membranas dendríticas y axonales contribuyen el transporte polarizado, la
fusn a MP y la retencn selectiva. Muchas proteínas sinápticas esn
fuertemente retenidas en la MP gracias a sistemas de andamiaje en el que
participan proteínas del citoesqueleto (Bork y col., 1997; Ledesma & Dotti,
2003; Leenders y col., 2008). Sin embargo, otras proteínas polarizadas en
axones o dendritas no presentan esta fuerte retención y no están n claros
los mecanismos que impiden su difusión lateral de un dominio al otro. Aunque
se postula la existencia de una barrera (Kobayashi y col., 1992; Futerman y
col., 1993; Winckler y col., 1999) no está aún clara la naturaleza de la misma
como es el caso de las uniones estrechas, conocidas como tight junctions”,
INTRODUCCIÓN | 10
en las células epiteliales (Stevenson & Keon, 1998).
El análisis de neuronas hipocampales en cultivo que desarrollan axones y
dendritas de manera secuencial y estereotipada ha sido y sigue siendo muy
útil para entender las señales iniciales y las vías de establecimiento de la
polaridad neuronal como se describirá s adelante (Kunda y col., 2001,
González-Billault y col., 2002; Calderon de Anda y col., 2008; Leach y col.,
2011; Dupraz y col., 2009; Sachdev y col., 2007).
1.2.4 COMPONENTES GLUCÍDICOS.
Estos componentes se encuentran en el exterior de la membrana formando el
glicocalix. Se unen covalentemente a las proteínas o a los lípidos. Pueden ser
polisaridos u oligosacáridos y sus principales funciones son dar soporte a la
membrana y el reconocimiento celular (Alberts y col., 2006).
INTRODUCCIÓN | 11
1.3 MICRODOMINIOS DE MEMBRANA: BALSAS LIPÍDICAS (RAFTS) COMO
ESTRUCTURAS DE MEMBRANA ALTAMENTE ORGANIZADAS.
Además de macrodominios diferenciados como son los axones, las dendritas
o la sinapsis, las membranas neuronales (y las de todas las células) cuentan
también con una compartimentalización a micro/nano escala. La afinidad
química que existe entre determinados lípidos, SLs y colesterol, que los lleva a
asociarse formando nanodominios que incorporan proteínas de manera
selectiva, es la base del concepto de balsa lipídica o raft.
La primera función asignada a los rafts fue la de contribuir a la generación
de la membrana apical de las células epiteliales rica en glicolípidos (Simons &
Van Meer, 1988). Durante mucho tiempo la existencia de rafts en células vivas
fue cuestionada ya que resultaba muy difícil visualizarlos por microscopía
convencional debido a su reducido tamaño y gran dinamismo. Sin embargo
el uso de nuevas técnicas y herramientas, como por ejemplo la toxina
colérica que se une al gangliósido enriquecido en rafts GM1, colorantes
lipófilos que detectan el grado de fluidez de la membrana como el Laurdan,
o técnicas que permiten analizar la interaccn y dinamismo de proteínas
marcadas como FRET (fluorescence resonance energy transfer), FRAP
(fluorescence recovery after photobleaching), SFTM (single fluorophore
tracking microscopy) o SPFT (single particle fluorescence tracking) han
permitido confirmar la existencia de los rafts en células vivas (Munro, 2003;
Sonnino & Prinetti, 2013). Gracias a estos estudios se ha llegado a la
elaboración de simuladores virtuales que interpretan la formación y la
INTRODUCCIÓN | 12
relevancia fisiogica de los rafts en distintos tipos celulares (Abe y col., 2012;
Toulmay & Prinz, 2013; Bennett & Tieleman, 2013).
El métodos extendido para el estudio de estas balsas lipídicas sigue
siendo sin embargo una técnica bioquímica basada en una característica
física de estos complejos de membrana: su resistencia a la extracción con
detergentes no iónicos a baja temperatura (4°C). El uso de distinos
detergentes (por ejemplo, Triton X-100, CHAPs, Lubrol, Triton X-114) en fo y el
fraccionamiento en gradientes de densidad permiten obtener las membranas
resistentes a detergentes (DRMs o rafts) en las fracciones ligeras del gradiente.
Este comportamiento se debe a la composición lipídica rica en SLs, colesterol
y el gangliósido GM1. Entre las proteínas con afinidad por rafts que se
obtienen en las fracciones ligeras después de la extracción en frío con
detergentes, esn las ancladas a la membrana a tras del grupo GPI, las
doblemente acetiladas y asociadas al colesterol, y proteínas palmitoiladas
(Schroeder y col., 1994; Hanada y col., 1995; Scheiffele y col., 1997; Simons &
Toomre, 2000).
En la actualidad, se acepta la definición de rafts establecida en el año
2006 durante el Keystone Symposium of Lipid Rafts and Cell Function: Las
balsas lipídicas de membrana o rafts son pequeños dominios de entre 10 y 200
nm, heterogéneos y muy dinámicos, enriquecidos en SLs y esteroles, que
compartamentalizan los procesos celulares. A veces, estas pequeñas balsas se
estabilizan y forman estructuras s grandes mediante interacciones proteína-
proteína y proteína-lípido” (Fig. 5).
INTRODUCCIÓN | 13
Proteína anclada por GPI
y
u
\
Proteína Tírosínkínasa Proteína de Transmembrana
Figura 5. Diagrama simplificado de un raft lipídico.
Los rafts se ensamblan en la región trans del aparato de Golgi (TGN)
donde se producen los SLs y entran en contacto con el colesterol
previamente sintetizado en el reculo endoplásmico y transportado luego al
TGN. El alto contenido en ácidos grasos saturados confiere a las membranas
de rafts más orden y menos fluidez teniendo una temperatura de fusn s
alta que otras zonas de la membrana (Harder y col., 1998). Ese alto grado de
empaquetamiento de las cadenas aciladas es esencial para la organización
de estos microdominos de membrana ya que hace que estas regiones ricas
en SLs formen una fase líquida ordenada (Lo) rodeada por dominios ricos en
glicerofosfolípidos que constituyen una estructura líquida desordenada (Ld),
(Munro, 2003; Lucero & Robbins, 2004) (Fig. 6).
INTRODUCCIÓN | 14
MEC
Citosol
mam
flÉW
i m
%
Raft
Proteínas
transmembrana
f f l lípidos t-.V " " cos
*: Proteína con
v anclaje GPI
T
Glicolípido Colesterol
Figura 6. Esquema de una balsa lipídica o raft de membrana. En la figura se muestran
algunos de los principales componenetes de la membrana plasmática, y cómo éstos se
organizan, interaccionan entre ellos y forman las balsas lipídicas. Figura gentilmente cedida
por Natalia Díez Revuelta.
Los rafts están implicados en muchos procesos celulares; participan no solo
en el correcto transporte de proteínas desde el TGN hacia la membrana
plasmática, sino tambn en ciertos procesos de endocitosis, transducción de
señales, proteólisis, adhesn celular y migracn, transmisión sináptica y en la
organización del citoesqueleto (Simons & Ikonen, 1997; Hancock, 2006; Orlandi
& Fishman, 1998; Parton & Richards, 2003; Sonnino & Prinetti, 2013).
INTRODUCCIÓN | 15
1.4 IMPORTANCIA DE LOS RAFTS EN EL DESARROLLO NEURONAL.
La maduración neuronal es un proceso gradual, donde el an y las dendritas
se diferencian primero morfológicamente para después adquirir una
composicn molecular distinta que les permite llevar a cabo sus diferentes
funciones. Sólo luego de adquirir la polarizacn molecular de la membrana
plasmática la neurona pod establecer sinapsis (Dotti y col., 1988).
Los diferentes cambios morfológicos y moleculares que ocurren durante la
diferenciación neuronal, desde que son células redondas hasta el desarrollo
de complejas ramificaciones dendticas y axonales, han sido caracterizados
en detalle en cultivos primarios de neuronas hipocampales derivados de
embriones de ratón o rata (Craig & Banker, 1994; Dotti y col., 1988; Calderon
de Anda y col., 2008; Leach y col., 2011).
Hasta llegar a su madurez, las neuronas hipocampales en cultivo pasan
por 5 estadíos diferenciables morfogicamente (Fig. 7). En el estadío inicial
inmediatamente posterior a la diseccn, las neuronas hipocampales tienen
una morfología redonda sin ningún tipo de procesos (Estadío 1). En el curso de
las siguientes 4 - 24 horas varios procesos con características morfológicas y
longitudes similares emergen del cuerpo celular (Estadío 2). Entonces, uno de
los procesos empieza a elongar más rápido gracias a un mayor transporte de
organelas de membrana y proteínas citosólicas (Bradke & Dotti, 1997),
mientras los demás permanecen estacionarios, y si nada lo impide este
proceso se convertirá posteriormente en el axón (Dotti & Banker, 1987). Esta
etapa es conocida como Estadío 3 del desarrollo neuronal y constituye el
INTRODUCCIÓN | 16
primer signo de polarización. El estadío 4 del desarrollo comienza después de 4
as en cultivo e implica la elongación tanto axonal como dendrítica. A este
punto, proteínas del citoesqueleto como la proteína asociada a microtúbulos
MAP2, comienza a ser segregada a los procesos dendríticos (Caceres y col.,
1984). Las neuronas en estadío 5 (desde los 7 as en cultivo en adelante)
tienen procesos axonales y dendríticos largos y muy ramificados con
numerosos contactos intercelulares (Fig. 8). En este momento, proteínas del
citoesqueleto como MAP2 y tau, y ciertas proteínas de membrana dendrítica
presentan distribución polarizada (Caceres y col., 1984; Craig y col., 1994; Rao
y col., 1998). La segregación molecular, al igual que la restricción de ciertas
proteínas de superficie y la agrupación de los receptores de neurotransmisores
y canales iónicos necesarios para la actividad sináptica, tiene lugar a partir de
los 13 - 15 días en cultivo y sólo entonces la neurona es totalmente funcional
(Craig y col., 1994). Por ello se asume que la asimetría funcional de la
membrana neuronal ocurre a tras de la maduración de dos mecanismos
del desarrollo: primero la maduración de la vía del transporte polarizado de
componentes de membrana y posteriormente el anclaje y agrupamiento de
los mismos en la superficie celular.
INTRODUCCIÓN | 17
Figura 7. Establecimiento de la polaridad en neuronas hipocampales en cultivo. Se
indica para cada estadío, el tiempo aproximado al cual se puede encontrar cada
fase expresado en días en cultivo, así como la morfología característica de cada uno.
Figura adaptada de Dotti y col. (1998)
Estadio 4
Figura 8. Imágenes representativas de los distintos estadíos del desarrollo neuronal. Neuronas
hipocampales en cultivo provenientes de cerebros de embriones de rata de 18 días de
gestación. Las barras blancas indican 10 Imágenes gentilmente cedidas por María
Dolores Ledesma Muñoz.
En neuronas, el establecimiento de los rafts es necesario para una correcta
maduración y mantenimiento del transporte polarizado de ciertas proteínas
hacia la membrana axonal. Así, la reducción farmacológica de los niveles de
colesterol o SLs en neuronas maduras suprime la polarización axonal de
INTRODUCCIÓN | 18
proteínas como la GPI Thy-1 (Ledesma y col., 1998). Además, el aumento de la
síntesis de esfingomielina durante el desarrollo es clave para la formación de
rafts y el estableciemiento de la polaridad axonal de esta proteína (Ledesma
y col., 1999). Es también importante destacar que los rafts participan en el
transporte polarizado de proteínas en otros tipos celulares de cerebro tales
como oligodendrocitos. De hecho, ciertas proteínas constitutivas de la capa
de mielina necesitan de éstos microdominios para asociarse con la misma
(Kramer y col., 1997).
A pesar de que hay evidencias de la participación de los rafts en el
desarrollo y funcionamiento neuronal, aun no se conocen en detalle los
mecanismos moleculares de esta participación, cuál es la contribucn de los
distintos lípidos de rafts, qué proteínas utilizan este mecanismo y si alteraciones
de rafts que afectan a la polaridad neuronal esn involucrados en la
patología de enfermedades neurogicas (Ledesma y col., 1998; Simons &
Ikonen, 1997; Ledesma y col., 2011). Por ello, esta tesis doctoral se ha centrado
en aportar información sobre estas cuestiones.
INTRODUCCIÓN | 19
1.5 NIEMANN-PICK TIPO A: UN EJEMPLO DE ENFERMEDAD NEUROLÓGICA
CAUSADA POR ALTERACIONES EN EL METABOLISMO DE LÍPIDOS.
De acuerdo con un papel relevante de los lípidos en el funcionamiento
neuronal muchas lipidosis cursan con problemas cognitivos, retardo mental y
neurodegeneracn. Entre ellas esn las esfingolipidosis provocadas por
alteraciones en el metabolismo de SLs que son componentes esenciales de los
rafts. La enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B (NPA y NPB) es una
esfingolipidosis causada por mutaciones en el gen SMPD1 que codifica para
la esfingomielinidasa ácida (ASM) (Brady y col., 1966). Ambos tipos se
caracterizan por un progresivo compromiso visceral, incluyendo
hepatoesplenomegalia, insuficiencia respiratoria y enfermedad
cardiovascular (Schuchman & Desnick, 2001). Sin embargo, mientras el NPB
tiene manifestaciones tardías y presenta leve o incluso ningún compromiso
neurogico, el NPA es la forma infantil caracterizada por deficiencias
cognitivas severas y por un proceso neurodegenerativo que conduce a la
muerte en los primero 3 - 4 años de vida. La presentación clínica diferente
entre ambos tipos de la enfermedad se debe a diferencias en la actividad
enzimática residual de la ASM. Mientras la actividad residual en NPB está
reducida pero es aún superior a un 5% de la actividad normal, en NPA la
actividad residual es menor al 1% de la normal (Graber y col., 1994). Estas
observaciones sugieren que mientras niveles bajos de actividad enzimática
son suficientes para mantener intacta la funcn neurológica, la ausencia
total de la misma tiene consecuencias devastadoras en el cerebro.
INTRODUCCIÓN | 20
La ASM es una enzima lisosomal que convierte a la SM en ceramida y
fosfocolina (Gatt, 1963; Fowler, 1969). Por lo tanto, la acumulación de SM en
los lisosomas caracteriza a las células de los pacientes con enfermedad de
Niemann-Pick (NPD), tanto tipo A como B, clasificando a esta patología como
una metabolopatía de depósito lisosomal (Futerman & van Meer, 2004). Se
supone que el almacenamiento lisosomal tiene lugar sólo cuando la actividad
residual de la enzima ASM cae por debajo de un umbral crítico donde la tasa
de degradación del sustrato es inferior a la tasa de recaptación (Conzelmann
& Sandhoff, 1983). La recaptación de SM en lulas neurales es menor que en
hígado, bazo o linfonodos y por ello se ha propuesto que los niveles bajos de
actividad enzimática en la enfermedad NPB son suficientes para impedir el
almacenamiento lisosomal en neuronas (Graber y col., 1994), evitando de
esta manera el severo compromiso neurogico.
Desafortunadamente, a pesar de esta correlación entre la actividad
enzimática residual y el fenotipo, los ensayos realizados in-vitro para medir la
actividad de la ASM no han sido suficientes para predecir el desarrollo y la
magnitud del compromiso neurológico en los pacientes con NPA. Más aún,
aunque el almacenamiento lisosomal de sustrato no metabolizado ha sido
considerado la causa principal de la enfermedad, el mecanismo molecular
que conduce a este evento patológico con compromiso neurológico aún se
desconoce.
Es muy probable que este defecto enzimático, considerado como
primario, desencadene muchas alteraciones bioquímicas y celulares
secundarias que podrían conducir a complicaciones mayores o incluso ser la
INTRODUCCIÓN | 21
principal causa del daño tisular y la muerte del paciente. Los SLs, incluida la
SM, ejercen muchas de sus funciones biológicas a nivel de la MP donde,
como ya se ha comentado, modulan la organizacn lateral de la membrana
afectando la función de las proteínas asociadas (Lingwood & Simons, 2010).
Por lo tanto, la deficiencia lisosomal de la ASM y el defecto resultante en el
catabolismo a nivel de esta organela podrían directamente conducir a una
alteración en la composicn y funcionamiento de la MP. Por otro lado, se ha
demostrado la presencia de una reserva de ASM en la superficie celular
(Grassmé y col., 2001; Gulbins, 2003) sugiriendo que independientemente del
defecto lisosomal, las alteraciones de la MP podrían deberse directamente al
defecto enzimático en este sitio celular. Un objetivo importante de esta tesis
ha sido investigar esta posibilidad.
Para ello, hemos utilizado un modelo animal (murino) para NPA creado por
técnicas de transferencia genética. En estos ratones el gen SMPD se truncó
(ratones ASMko) por lo que no se expresa la ASM, lo cual lleva a la ausencia
total de actividad de la enzima en todos los tejidos incluido el cerebro. Este
modelo presenta los mismos síntomas que los pacientes con NPA entre los que
se encuentran: el declive motor progresivo que deriva en ataxia,
neurodegeneración y muerte temprana (a los 7 - 8 meses de edad)
(Horinouchi y col., 1995). En el cerebro de estos ratones la falta de ASM lleva a
la acumulación de la SM que es uno de los principales componentes de rafts.
Por ello consideramos que el ratón ASMko es una herramienta ideal para
estudiar tanto in-vitro como in-vivo la repercusión de alteraciones de rafts en
la polaridad neuronal y su posible contribucn al desarrollo de la NPA, que
hoy en día no tiene cura ni tratamiento, causando deficiencias cognitivas
severas.
INTRODUCCIÓN | 22
2. HIPÓTESIS y OBJETIVOS
Considerando el marco teórico descripto proponemos como hipótesis de
trabajo que la falta de actividad de la ASM provoca dos situaciones aberrantes
que producen alteraciones en los rafts. Por una parte, existe un bloqueo de la
produccn de ceramida a partir de SM en los lisosomas. Esto disminuye la
cantidad de ceramida disponible en el TGN para sintetizar de novo SM, lo que
conduce a una menor formación de rafts.
Por otro lado, la falta de actividad de ASM a nivel de la membrana
plasmática provoca un aumento de la cantidad de SM a ese nivel alterando la
composición y las funciones de los rafts en la superficie celular.
Para el abordaje de ésta hipótesis de trabajo con dos escenarios, nos
planteamos los siguientes objetivos:
OBJETIVO GENERAL:
Comprender los mecanismos moleculares por los que los rafts participan en la
polaridad neuronal y determinar si alteraciones en estos mecanismos
contribuyen a la patología de la enfermedad de Niemann-pick tipo A.
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS | 24
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
-I- Caracterizar marcadores proteicos neuronales cuya polarizacn depende
de rafts.
-I- Determinar el mecanismo de la polarización dependiente de rafts.
-I- Caracterizar las alteraciones en la composición lipídica y proteica de los
rafts neuronales en el ratón modelo para NPA que carece de ASM.
-I- Determinar si la polarización dependiente de rafts se ve afectada en
neuronas carentes de ASM, y si es así, caracterizar el mecanismo molecular
aberrante.
-I- Ensayar estrategias de rescate de los fenotipos aberrantes.
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 MODELO EXPERIMENTAL MURINO.
Una colonia de ratones heterocigotas para el gen codificante de la ASM
(Cg5BL) (Horinouchi y col., 1995) se estableció a partir de dos parejas
gentilmente donadas por el dr. Schuchman (Mount Sinai School of Medicine,
New York). Los experimentos se realizaron usando ratones wt o ASMko de 7
meses de edad, cuyo genotipo se determinó a partir de ADN genómico
mediante reacción de PCR según fue descripto por Horinouchi y col. (1995).
Todos los procedimientos que necesitaron el uso de animales fueron
supervisados por el veterinario encargado del bioterio, siguiendo las guías de
proteccn y bienestar animal publicadas por el Ministerio de Salud Italiano
(DDL 116/92).
MATERIALES Y MÉTODOS | 26
3.2 REACTIVOS y ANTICUERPOS.
Cultivos: DMEM, Glucosa, HEPES, KH2PO4, L-Glutam¡na, MEM, Sigma-Aldrich
MgSO4, NaCl, NaHCO3, NGF, Poly-L-Lisina, Tripsina
CaCI2, KCI, MgCh, Na2HP04 «Merck
Neurobasal, Penicilina-Estreptomicina, Suero de • Invitrogen
Caballo, Suero fetal bovino (FBS), Suplemento B27
Tratamientos:
Tinción /n-situ e
Inmunofluorescencias
Subunidad p> de la toxina colérica conjugada con
Fluoresceina, Fumonicin B (FB1), SM, Simase,
Methyl-p>-cyclodextrin (Mp>C), Mevilonin
FM4-64
• Ácido pirúbico (C
3 H4O3), BSA, Cloruro de Amonio
(NH4Cl), DABCO, EGTA, Glucosa, Hepes, KH2 PO4,
Lactosa, Laminina, L-Glutamina, NaCl, NaHCO3,
Sacarosa, Triton X-100
Gelatina 80-100 blooms, PFA
Suero fetal bovino (FBS)
Ácido tricloroacético (TCA), KCl, Metanol, Na2HPO4
Mowiol
Parafina
Sigma-Aldrich
Molecular Probes
> Sigma-Aldrich
• Panreac
• Invitrogen
Merck
Calbiochem
• Fluka
Bioquímica • Acrylamida/bis-Acrylamida, Azul de bromofenol, CLAP,
EDTA, Glucosa, Glicina, Glycerol, Hepes, MES, NaCl, NaHCO3,
Sigma-Aldrich
NP-40, Sacarosa, Triton X-100; Trizma base, Tween-20,
B-mercaptoetanol (p>-ME)
Ácido clorhídrico (HCl), CaCk, Cloroformo, Deoxicolato
Merck
Sódico, KCl, Metanol, MgCk
SDS
GE-Healthcare
DSP, DTSSP
Pierce
APS, TEMED
Bio-Rad
Tabla 1. Reactivos. En la tabla se muestra un listado de los reactivos empleados para la
realización del presente trabajo distribuídos por técnicas de experimentación (cultivos celulares,
tratamientos, ensayos
¡n-s¡fu e inmunocitoquímica y bioquímicos), y ordenados en función de la
casa comercial de la que son originarios.
MATERIALES Y MÉTODOS | 27
Nombre Especie Concentracn Origen
Y-Adaptin Ratón 1:5000 BD Biosciences
Bip Ratón 1:2500 BD Biosciences
GM-130 Ratón 1:500 BD Biosciences
Lamp-2 Ratón 1:250 BD Biosciences
Synaptophysin Ratón 1:50 Chemicon
clon Sy-38
Anti-TfRc Conejo 1:50 Sta. Cruz Biotechnology
clon CD-71
APP Ratón 1:100 Chemicon
clon 22C11
Flotillin-1 Ratón 1:100 BD Biosciences
PrPC (Pom-1) Ratón 1:100
Gentilmente provisto por
Dr. A. Aguzzi (Institute of
clon Ag1193
Neuropathology, Zurich,
Switzerland)
MAP2 Conejo 1:2000 Peninsula Laboratories
RhoA Ratón 1:200 Sta. Cruz Biotechnology
clon 26C4
Cdc-42 P1 conejo 1:200 Sta. Cruz Biotechnology
a-Tubulin Ratón 1:2000 Sigma
Tau-1 Ratón 1:1000 Millipore
clon PC1C6
Thy-1 (CD-90) Ratón 1:100 Serotec
Anti-GluR1 Conejo 1:50 Upstate
Anti-MBP Ratón 1:200 Thermo Scientific
Tabla 2. Anticuerpos primarios. En la tabla se muestra un listado de los anticuerpos primarios
empleados para la realización de inmunofluorescencias indicando el nombre completo del
anticuerpo, la especie animal reactiva, la concentración empleada y la casa comercial de la
que son originarios.
Para Western blots, los anticuerpos anti PrPc, a-Tubulin y Flotillin-1 se usaron
diluídos 1:500. La subunidad p de la toxina colérica (Sigma) se usó diluida 1:1000
en los slot-blots.
MATERIALES Y MÉTODOS | 28
Se utilizaron anticuerpos secundarios anti-especie (Molecular Probes)
conjugados con diferentes fluoróforos Alexa Fluor 488, 594 o 647 (1:1000) para
las inmunofluorescencias o conjugados con HRP (1:2000) para WB.
3.3 CULTIVOS CELULARES.
Cultivo primario de neuronas hipocampales provenientes de rata y ratón.
Los cultivos de neuronas hipocampales de rata o ratón se obtuvieron a partir de
embriones de 18 o 16 días de gestación (E18, E16, respectivamente) sen el
protocolo descripto por Goslin y Banker en 1989 (Goslin & Banker, 1989; Kaech &
Banker, 2006). El motivo por el que se eligieron células de E18 o E16 es porque
en estos estadíos la gran mayoría de las neuronas hipocampales de rata o
ran, respectivamente, han finalizado su división celular pero la diferenciación
no ha acabado completamente encontrándose en el momento ideal para el
estudio de su desarrollo (Dotti y col., 1988).
Para la obtención de estas células se extrajo el cerebro de los embriones y
se diseccionó el hipocampo; el tejido se limp de restos de meninges y se lavó
con solución tamponada de Hank libre de iones Ca2+ y Mg2+, atemperada a
37°C (HBSS sin Ca2+/Mg2+; compuesto por 137mM NaCl, 5.36mM KCl, 0.34mM
Na2HPO4, 0.44mM KH2PO4, 4.2mM NaHCO3, 5.6mM glucosa, pH 7.4). El tejido
limpio se disgregó mecánicamente con una pipeta Pasteur de vidrio y se trató
MATERIALES Y MÉTODOS | 29
con tripsina durante 15 minutos a 37°C. Se hicieron lavados de nuevo con HBSS
con iones Ca2+ y Mg2+ (HBSS; compuesto por 137mM NaCl, 5.36mM KCl, 1.26mM
CaCl2, 0.5mM MgCl2, 0.4mM MgSO4, 0.34mM Na2HPO4, 0.44mM KH2PO4, 5.6mM
glucosa, 0.7% Hepes, pH 7.4), y se cuantificó el número de lulas por mililitro
con una cámara de Neubauer (Brand).
Las células disgregadas se sembraron en placas de Petri de 60 milímetros
(Nunc) para los estudios de bioquímica o en placas con cubreobjetos (CVs) de
vidrio (Marienfeld) para los estudios de microscopía, ambos recubiertos con
Poly-L-Lysina (PLL, Sigma). El recubrimiento de las placas de Petri se realizó por
incubación con una suspensión de PLL 0.1 mg/mL durante 12 horas a 37°C. Para
el recubrimiento de los CVs se utilizaron vidrios secuencialmente tratados con
ácido nítrico (al 50% V/V), lavados con agua destilada y esterilizados por calor
seco durante 2 horas a 20C. Sobre la superficie de cada CV se aplicaron tres
pequeñas gotas de parafina equidistantes. Una vez seca la parafina, se
recubrieron con una suspensión de PLL 1 mg/mL durante 12 horas a 37°C. Tras
varios lavados con agua destilada el material quedó listo para los cultivos
celulares (Fig. 57, paso 1).
Las suspensiones celulares se sembraron a una densidad de 15x104 células
por placa de 60 milímetros con o sin CVs y se mantuvieron en medio mínimo
esencial (MEM; minimal essenfial médium) suplementado con 10% de suero de
caballo (MEM-HS) y 0,6% de glucosa, en un incubador con atmósfera húmeda
(modelo C150, Binder) al 5% de CO2 y 37°C. A las 24 horas los CVs se
traspasaron a una nueva placa en posición invertida de forma que las gotas de
parafina quedaron en contacto con el pstico. La placa contenía medio
MATERIALES Y MÉTODOS | 30
Neurobasal suplementado con 2% B-27 y 0.5 mM de L-Glutamina (NB-B27)
previamente atemperado y equilibrado a 5% de CO2 (Fig. 57, paso 2).
Para nuestros experimentos, las células se mantuvieron en cultivo por 3 días
(neuronas inmaduras en estadío 3), o por 8 -15 as (neuronas maduras en
estadío 5).
FIGURA 57. Esquema del proceso de disección y cultivo primario de neuronas hipocampales. En
el paso 1 se describe la preparación de CVs de vidrio recubiertos de PLL con gotas de parafina
para el cultivo de neuronas. En el paso 2 se representa el proceso de extracción de
hipocampos y la obtención y siembra de neuronas hipocampales sobre los CVs previamente
preparados. Figura adaptada de Kaech & Banker (2006) y gentilmente cedida por Natalia Díez
Revuelta.
MATERIALES Y MÉTODOS | 31
3.4 ESTUDIOS REALIZADOS CON NEURONAS HIPOCAMPALES DE RATA.
3.4.1 Purificación de rafts usando Triton X-100.
Las neuronas hipocampales se lavaron en tampón fosfato (PBS) en frío y se
extrajeron con tampón MBS (25 mM MES, 150 mM NaCl, pH 6,5) y CLAP (25
|jg/mL de cada uno de los siguientes inhibidores de proteasas: quemostatina,
leupeptina, antipaina y pepstatina) conteniendo 1% Triton X-100. Luego de 60
minutos de incubación a 4°C en agitación, se cuantificó la cantidad de
proteína total empleando un kit comercial basado en el método del ácido
bicinconínico (BCA, Bio-Rad Protein Assay Kit). A 1 ml de muestra conteniendo
100 jg de proteínas se le añadieron 2 mL de sacarosa al 90% P/V para llegar a
una concentración final de 60% P/V sacarosa. La mezcla se depositó en el
fondo de tubos de ultracentfuga de 12 mL de capacidad (Beckman Coulter).
Sobre estas muestras, se añadieron 4 mL de sacarosa al 35% P/V y 4 mL s al
5% P/V, cuidando que no se mezclaran entre sí para formar un gradiente
discontinuo de densidad. Los tubos se ultracentrifugaron a 155.000 x g durante
18 horas a 4°C (Optima L-100 XP Ultracentrifuge, rotor SW-41, Beckman Coulter).
Partiendo de la superficie del líquido en los tubos se recogieron 11 fracciones
de 1 mL cada una. Las fracciones 4 - 5 se identificaron como fracciones de
rafts por la presencia de marcadores específicos de estos dominios de
membrana en muestras control.
MATERIALES Y MÉTODOS | 32
3.4.2 Purificacn de rafts por sonicación.
Como método alternativo al aislamiento de rafts con detergentes se utilizó en
algún caso el aislamiento por sonicación sen lo descripto en Smart y col.,
1995. Neuronas hipocampales en cultivo se lavaron en tampón fosfato (PBS) frío
y se recogieron en 1 mL de tampón MBS. Las células se homogeneizaron por
medio de 10 pasajes a tras de una aguja 22-G y se sonicaron usando el 130-
W Ultrasonic Processor programado a un ritmo de 12 ráfagas de 5 segundos
cada una. El homogenato se fraccionó en gradiente de sacarosa como se
describ con anterioridad.
3.4.3 Reducción de colesterol.
La reducción de colesterol en neuronas hipocampales se llevó a cabo tratando
las células a los 5as en cultivo con 0,4 jM Mevilonina y 0,5 mM Metyl-p-
Ciclodextrina (MpC) durante 5 días.
3.4.4 Reduccn de Esfingolípidos.
La reducción de SLs en neuronas hipocampales se llevó a cabo agregando, a